28 TCN199 : 2004: Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định tính bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction.

Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định tính bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction

Salmonella in fishery products - Method for qualitative analysis by Polymerase Chain Reaction

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính Salmonella trong sản phẩm thuỷ sản bằng kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (sau đây gọi tắt là PCR).

2 Tài liệu tham khảo

- Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay. (CHENG HSUN CHIU AND JONATHAN T.OU. - Journal of Clinical microbiology, p.2619-2622. Oct. 1996).

- Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction. (JS. WAY, KL. JOSEPHSON, SD. PILLAI, M. ABBASZADAGAN, CP. GERBA AND IL. PEPPER. - Appl. Environ. Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993).

- Detection of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in Suspended Organic Waste by Nucleic Acid Extraction and PCR. (CAROLA BURTSCHER, PAPA A. FALL, PETER A. WILDERER, AND STEFAN WUERTZ. - Appl. Environ. Microbiol. 65 (5): 2235 - 2237, 1999).

- Nordic commitees on food analysis (NMKL) No 71, 5^th ed., 1999, Salmonella - Detection in foods.

3 Giải thích thuật ngữ

Trong Tiêu chuẩn này, các thuật ngữ dưới đây được hiểu như sau :

3.1 Salmonella

Giống Salmonella là vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruộtenterobacteriaceae có hơn 2400 kiểu huyết thanh. Salmonellalà trực trùng Gram âm, kích thước khoảng 0,6 - 2,0 mm, hiếu khí, có thể di động, không tạo bào tử, sinh hơi lên men dextrosa, sinh khí đihyđrosunfua.

Tất cả các khiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm geninv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI - 1 (Salmonellapathogenicity island) có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt trong hệ thống gen inv.

3.2 Kỹ thuật PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại số lượng bản sao của một trình tự AND đích qua các chu kỳ gồm 3 bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym ADN polymerase.

3.3 ADN đích (target ADN)

Trong kỹ thuật PCR, ADN đích được hiểu là một đoạn ADN đặc trưng cho đối tượng cần phát hiện. Trong Tiêu chuẩn này, ADN đích là một đoạn trong gen invA.

3.4 Biến tính là sự chuyển từ sợi ADN dạng mạch kép sang dạng mạch đơn dưới tác dụng của tác nhân biến tính. Trong Tiêu chuẩn này, tác nhân biến tính là nhiệt.

3.5 Bắt cặp bổ sung là sự kết hợp giữa hai mạch ADN hay một ADN mạch đơn với ARN có các trình tự bổ sung để tạo nên một mạch kép.

3.6 ADN polymerase là enzym tổng hợp nên mạch ADN mới từ một mạch khuôn. Phương pháp này sử dụng Taq ADN polymerase là một ADN polymerase hoạt động ở nhiệt độ cao.

3.7 Mồi là một trình tự ADN hay ARN ngắn bắt cặp với một mạch khuôn ADN có mang một đầu 3' - OH tự do giúp ADN polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới.

4 Nguyên tắc

Phương pháp định tính này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agarose, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn UV có bước sóng là 302 mm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.

5 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và môi trường

5.1 Thiết bị, dụng cụ

5.1.1 Tủ ấm 37^oC.

5.1.2 Máy luân nhiệt.

5.1.3 Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml.

5.1.4 Máy lắc ống nghiệm.

5.1.5 Thiết bị điện di ngang và bộ nguồn điện di có điện thế hoạt động từ 80 đế 150 volt.

5.1.6 Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm.

5.1.7 Bộ chụp ảnh trên đèn UV.

5.1.8 ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR.

5.2 Hoá chất, môi trường

5.2.1 Mồi

Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonellavào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau :

invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3'

invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3'

Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE. Ðệm TE có thành phần như sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA.

5.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và các loại hoá chất khác

Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây.

Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết của các thành phần và nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh và sinh học phân tử.

5.2.2.1 Dung dịch đệm pepton

Pepton (C₅H₁₀O₅): 10,0g

Natri clorua (NaCl): 5,0g

Ðinatri hyđro phôt phat (Na₂HPO₄): 3,6 g

Kali đihyđro phôt phat (KH₂PO₄): 1,5g

Nước cất: 1000 ml

Hoà tan các thành phần trong nước cất, đun tan, phân phối vào trong các bình chứa phù hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121^oC trong 15 phú. pH sau khi khử trùng là 7,0 0,2 ở 25^oC.

5.2.2.2 Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x

Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml)

Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25^oC): 75 mM

Sunphat amon (NH₄)_2ư SO₄: 20 nM

Tween 20: 0,01% (v/v)

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại)

Magiê clorua (MgCl₂) 1,5 mM

Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ 4^oC trong 1 tháng. Có thể bảo quản ở nhiệt độ - 20^oC trong 1 năm. Không nên rã đông và tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần.

5.2.2.3 Thang ADN

Nên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong phương pháp này.

5.2.2.4 Agarose

Sử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ hơn 1000 bp.

5.2.2.5 Ðệm điện di TAE 1x

Tris: 4,84 g

Na₂EDTA 0,5M, pH = 8,0: 2 ml

Axit axetic băng: 1,14 ml

Nước cất cho đủ: 1000 ml

Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng với nước thành dung dịch 1x.

5.2.2.6 Ðệm tải mẫu 6x

Glyxerol: 30 %

Xanh bromphenon: 0,25 %

Tris: 200 mM

Na₂EDTA: 20 mM

Các thành phần trên được pha trong nước cất, bảo quản ở nhiệt độ 4^oC.

5.2.2.7 Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml

6 Phương pháp tiến hành

6.1 Lấy mẫu

Cân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào bình tam giác hoặc bao PE vô trùng.

6.2 Tăng sinh

Nhằm làm tăng số lượng Salmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn thương cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.

ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0^oC 1,0^oC trong khoảng 18 giờ 2 giờ.

6.3 Xử lý mẫu giải phóng ADN

Giai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN. Cách xử lý như sau:

6.3.1 Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.

6.3.2 Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô trùng. Ðun sôi cách thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại.

6.4 Khuếch đại

Giai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt (thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

6.4.1 Chuẩn bị ống khuếch đại

Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR có thể tích 0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồiinvA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.

Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết.

Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước cất vô trùng.

6.4.2 Chương trình khuếch đại

Các ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như sau:

Duy trì nhiệt độ 95^oC trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95^oC/60 giây; 54^oC/45 giây và 72^oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72^oC trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20^oC cho đến khi điện di.

6.5 Ðiện di sản phẩm khuếch đại

6.5.1 Chuẩn bị gel điện di agarose 1%

Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.

6.5.2 Chuẩn bị dịch điện di

Mẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều.

6.5.3 Ðiện di

Một giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 vôn.

6.6 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại

6.6.1 Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu

Pha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.

6.6.2 Nhuộm gel

Ngâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nước trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư.

6.6.3 Quan sát, chụp hình

Cho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả.

7 Ðọc và giải thích kết quả

Kết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này.

Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.

8 Qui định về đảm bảo an toàn

Trong quá trình tiến hành thao tác phải thực hiện đúng các qui định sau đây:

8.1 Thuốc nhuộm etyl bromua là một chất độc có thể gây ung thư cho người và động vật. Do đó, khi sử dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ. Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ.

8.2 Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ.

8.3 Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu.

8.4 Phòng thí nghiệm phải được bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khi khuếch đại và khu xử lý sản phẩm sau khi khuếch đại để tránh hiện tượng nhiễm chéo gây kết quả dương tính giả

Xem chi tiết

28 TCN200:2004: Vibrio cholerae trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định tính

Vibrio cholerae trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định tính

Vibrio cholerae in fishery products - Method for qualitative analysis

1 Phạm vi áp dụngTiêu chuẩn này qui định phương pháp định tính vi khuẩn Vibrio cholerae trong sản phẩm thuỷ sản.
2 Phương pháp tham chiếuTiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo chương 9, Sổ tay phân tích vi sinh, tái bản lần 8 năm 1998 của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ.
3 Nguyên tắcVibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae là phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng di động, phản ứng oxidaza dương tính, phát triển được ở nhiệt độ 42⁰C, lên men đường sacaroza, khử lysin; phát triển được ở môi trường không có muối nhưng không phát triển được ở môi trường có nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat.
Phát hiện Vibrio cholerae bằng cách tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc và cấy chuyển phân lập trên môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.
4 Thiết bị, dụng cụ và môi trường, thuốc thử4.1 Thiết bị, dụng cụ
4.1.1 Tủ ấm (37,0⁰C 1,0⁰C).
4.1.2 Bể điều nhiệt (42,0⁰C 0,2⁰C).
4.1.3 Cân có độ chính xác 0,0001 g.
4.1.4 Máy nghiền đồng thể.
4.1.5 Máy lắc ống nghiệm.
4.1.6 Ðĩa petri.
4.1.7 ống nghiệm đường kính các cỡ: 13, 16 và 18 mm.
4.1.8 Một số thiết bị thông thường khác như: máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh.
4.2 Môi trường, thuốc thử
4.2.1 Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW)
Pepton : 10,00 g
Natri clorua (NaCl) : 10,00 g
Nước cất : 1,00 lít pH = 8,5 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi.
4.2.2 Môi trường phân lập: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacaroza (TCBS thạch)
Pepton : 10,00 g
Cao nấm men : 5,00 g
Natri xitrat : 10,00 g
Natri thiosunphat (Na₂S₂O₃) : 10,00 g
Mật bò : 5,00 g
Sacaroza : 20,00 g
Natri clorua (NaCl) : 10,00 g
Sắt (III) xitrat (FeC₆H₅O₇) : 1,00 g
Natri cholate : 3,00 g
Xanh bromthymol : 0,04 g
Xanh thymol : 0,04 g
Thạch : 15,00 g.
Nước cất vô trùng : 1,00 lít pH = 8,6 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C).
Ðun sôi để hoà tan hoàn toàn các thành phần rồi làm nguội ngay tới nhiệt độ khoảng 50⁰C. Rót 15 - 20 ml vào các đĩa petri vô trùng. Trước khi sử dụng phải làm khô đĩa môi trường bằng cách để qua đêm ở nhiệt độ trong phòng hoặc đặt đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 37⁰C - 45⁰C.
Chú thích: không hấp khử trùng môi trường
4.2.3 Môi trường, thuốc thử sinh hoá
4.2.3.1 Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar -TSI
Pepton : 15,00 g
Proteose pepton : 5,00 g
Cao thịt bò : 3,00 g
Cao nấm men : 3,00 g
Natri clorua (NaCl) : 5,00 g
Lactoza : 10,00 g
Sacaroza : 10,00 g
Glucoza : 1,00 g
Sắt (II) sunphat (FeSO₄) : 0,20 g
Natri thiosunphat (Na₂S₂O₃) : 0,30 g
Ðỏ phenol : 0,024 g
Thạch : 12,00 g
Nước cất : 1,00 lít pH = 7,4 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm.
4.2.3.2 Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar -KIA
Polypepton pepton : 20,00 g
Natri clorua (NaCl) : 5,00 g
Lactoza : 20,00 g
Dextroza : 1,00 g
Sắt ammoni xitrat : 0,50 g
Natri thiosulphat (Na₂S₂O₃) : 0,50 g
Phenon đỏ : 0,025 g
Thạch : 15,00 g
Nước cất : 1,00 lit pH = 7,4 0.2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Cách pha như qui định tại Ðiều 4.2.3.1
4.2.3.3 Hugh - Leifson Glucoza
Pepton : 2,00 g
Cao nấm men : 0,50 g
Natri clorua (NaCl) : 30,00 g
Dextroza : 10,00 g
Tím bromcresol : 0,015 g
Thạch : 3,00 g
Nước cất : 1 ,00 lít pH = 7,4 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Ðun nóng để hoà tan hoàn toàn các thành phần trên rồi chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút.
4.2.3.4 O/F Glucoza
Trypton : 2,00 g
Natri clorua (NaCl) : 5,00 g
Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄) : 0,30 g
Xanh bromthymol : 0,03 g
Thạch : 2,00 g
Glucoza : 10,00 g
Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Ðun sôi để hoà tan các thành phần rồi rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút .
4.2.3.5 Canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T₁N₀; T₁N₁; T₁N₃; T₁N₆; T₁N₈ và T₁N₁₀)
Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đó, thêm lần lượt : 10, 30, 60, 80 và 100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl như trên. Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C). Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút.
Chú thích: các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối.
4.2.3.6 Môi trường thử decarboxylaza (Môi trường cơ bản)
Pepton : 5,00 g
Cao nấm men : 3,00 g
Glucoza : 1,00 g
Tím bromcresol : 0,02 g
Nước cất : 1,00 lít pH = 6,5 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g một trong các loại axitamin: L-lysin hoặc L-arginin hoặc L-ornithin vào môi trường cơ bản trên. Sau đó, rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 10 phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy.
4.2.3.7 Canh thang urê
urê : 20,00 g
Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄) : 9,50 g
Dikali hydro phosphat (K₂HPO₄) : 9,10 g
Cao nấm men : 0,10 g
Ðỏ phenol : 0,01 g
Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 0,1 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Hoà tan các thành phần. Không được hấp khử trùng, lọc vô trùng bằng màng lọc có đường kính lỗ là 0,45 ml. Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào các ống nghiệm hoặc đĩa petri đã được sấy vô trùng.
4.2.3.8 Canh thang bromcresol ( Môi trường cơ bản)
Pepton : 10,00 g
Natri clorua (NaCl) : 5,00 g
Cao thịt bò : 3,00 g
Tím bromcresol : 0,04 g
Nước cất : 1,00 lít pH = 7,0 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH sao cho môi trường sau khi pha đạt yêu cầu như trên rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 10 phút.
Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton và D-mannoza) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản. Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%.
4.2.3.9 Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl
Trypton : 10,00 g
Natri clorua (NaCl) : 20,00 g
Thạch : 20,00 g
Nước cất : 1,00 lít pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 25⁰C)
Ðun sôi để hoà tan các thành phần trên. Hấp ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút. Sau đó, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 - 50⁰C rồi rót ra đĩa hoặc ống nghiệm.
4.2.3.10 Thuốc thử Oxidaza
Hoà tan 1,0 g N,N, N^', N^'-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng. Ðựng dung dịch trong lọ sẫm màu hoặc bọc lọ trong giấy bạc. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 8⁰C, sử dụng trong vòng 7 ngày.
4.2.3.11 Dầu khoáng vô trùng
Rót khoảng 20 - 50 ml dầu khoáng vào bình có nắp xoáy. Hấp dầu ở nhiệt độ 121 ⁰C trong 30 phút.
4.2.3.12 Thuốc thử ONPG
Dung dịch đệm:
Natri dihydro phosphat ngậm 1 phân tử nước (NaH₂PO₄.H₂O) : 6,90 g
Nước cất : 45,00 ml
Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml
Hoà tan NaH₂PO₄.H₂O trong nước cất. Thêm dung dịch NaOH 30% và chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 25⁰C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 8⁰C.
Dung dịch ONPG:
ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg
Nước cất ở 37⁰C : 15,00 ml
Dung dịch đệm : 5,00 ml
Hoà tan ONPG trong nước cất ở nhiệt độ 37⁰C. Thêm dung dịch đệm vào rồi lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8⁰C. Trước khi sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 37⁰C.
Chú thích: có thể sử dụng đĩa ONPG được sản xuất sẵn thay cho dung dịch ONPG.
4.2.3.13 Các đĩa 10 mg và 150 mg O/129 Vibriostat
Cắt giấy lọc thành các mảnh tròn đường kính khoảng 5 - 6 mm rồi đặt vào các đĩa petri, hấp khử trùng.
Chuẩn bị đĩa 150 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl - pteridin photphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 15,0 mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa.
Chuẩn bị đĩa 10 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl - pteridine phosphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1,0mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa.
Sấy khô các đĩa, bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng.
4.2.3.14 Dung dịch nước muối sinh lý
Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121⁰C trong 15 phút rồi để nguội.
5 Phương pháp tiến hành5.1 Chuẩn bị mẫu
5.1.1 Chuẩn bị mẫu thuỷ sản
Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW (4.2.1) vào túi, nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2 phút.
5.1.2 Chuẩn bị mẫu hàu
Lấy phần thịt của 10 - 12 con hàu (kể cả nước) rồi cắt nhỏ, trộn đều. Sau đó, nghiền bằng máy nghiền đồng thể 50 g mẫu hàu trong 450 ml nước pepton kiềm APW (4.2.1) trong 2 phút. Chia dung dịch mẫu này vào 2 bình vô trùng, mỗi bình chứa 250 ml rồi pha loãng thành hai dãy bằng cách trộn đều 10 ml dung dịch mẫu trong 90 ml nước pepton kiềm APW (4.2.1). ủ mẫu ở hai chế độ nhiệt là 37,0⁰C 1,0⁰C và 42,0⁰C 0,2⁰C theo như qui định tại Ðiều 5.2.
5.2 Tăng sinh
5.2.1 Ðối với mẫu thông thường
ủ các bình chứa mẫu đã chuẩn bị tại Ðiều 5.1.1 (kể cả mẫu chứng dương và mẫu chứng âm) ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0⁰C trong 6 - 8 giờ. Sau đó, phân lập như qui định tại Ðiều 5.3, phần còn lại ủ tiếp 16 - 24 giờ rồi phân lập lại.
5.2.2 Ðối với mẫu hàu
ủ 1 dãy pha loãng 10^-1 đến 10^-2 ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0⁰C trong 6 - 8 giờ và 16 - 24 giờ.
ủ 1 dãy pha loãng 10^-1 đến 10^-2 ở nhiệt độ 42,0⁰C 0,2⁰C trong 6 - 8 giờ.
5.3 Phân lập và đọc kết quả trên đĩa
Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trên (5.2), không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch (4.2.2). ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0⁰C trong 18 - 24 giờ.
Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V. cholerae tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh.
5.4 Thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh
5.4.1 Thử nghiệm sinh hoá sơ bộ
Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl (4.2.3.9). ủ ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0^oC trong 18 - 24 giờ. Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh hoá.
5.4.1.1 Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA
Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) vào các ống thạch nghiêng TSI (4.2.3.1) hoặc KIA (4.2.3.2). Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0⁰C trong 18 - 24 giờ.
Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H₂S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H₂S.
5.4.1.2 Thử nghiệm với các canh thang trypton muối
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % (4.2.3.5). Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0 1,0 ⁰C trong 18 - 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường.
5.4.1.3 Thử nghiệm lên men - oxy hoá
Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza (4.2.3.3) hoặc O/F glucoza (4.2.3.4). Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng (4.2.3.11) vào một trong 2 ống. ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37,0 1,0⁰C trong 1 - 2 ngày. V. cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng.
5.4.1.4 Thử nghiệm oxidaza
Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza (4.2.3.10). Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA (5.4.1) ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây .
Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này.
5.4.1.5 Nhuộm gram
V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.
5.4.2 Thử nghiệm sinh hoá khẳng định
5.4.2.1 Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 42⁰C
Cấy vi khuẩn từ TSA (5.4.1) vào một ống canh thang trypton 1% NaCl (4.2.3.5). ủ ở nhiệt độ 42,0⁰C 0,2⁰C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42⁰C làm môi trường bị đục.
5.4.2.2 Thử nghiệm cacbonhydrat
Cấy vi khuẩn từ TSA (5.4.1) vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D-mannoza (4.2.3.8). ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0⁰C. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.
V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza, cellobioza, arabinoza âm tính.
5.4.2.3 Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza
Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA (5.4.1) vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin (4.2.3.6) và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng (4.2.3.11). ủ các ống ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0 ⁰C trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).
V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính.
5.4.2.4 Thử nghiệm urê
Cấy vi khuẩn từ TSA (5.4.1) vào canh thang urê (4.2.3.7), ủ ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0⁰C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng.
5.4.2.5 Thử nghiệm ONPG
Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI (5.4.1.1) hoặc từ môi trường không chọn lọc khác có chứa 1,0% lactoza vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG (4.2.3.12). ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37,0⁰C 1,0⁰C. Kiểm tra ống định kỳ trong 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng.
Có thể dùng đĩa ONPG (4.2.3.12) thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên.
5.4.2.6 Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat
Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl (4.2.3.9). Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat ( 4.2.3.13) vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37,0 1,0⁰C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129.
5.4.3 Thử nghiệm kháng huyết thanh
Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý (4.2.3.14) lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA (5.4.1) lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện.

Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 1 và Bảng 2.

Bảng 1 - Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1

Kháng nguyên	Kháng huyết thanh đa giá O1	Dung dịch muối sinh lý	Kết luận
Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae	+	-	V.cholerae O1
Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae	-	-	V.cholerae non- O1
Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae	+	+	Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm 1

Bảng 2 - Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1

Kháng nguyên	Kháng huyết thanh Inaba	Kháng huyết thanh Ogawa	Dung dịch muối sinh lý	Kết luận
V. cholerae O1	+	-	-	Chủng Inaba
V. cholerae O1	-	+	-	Chủng Ogawa
V. cholerae O1	+	+	-	Chủng Hikojima
V.cholerae O1	-	-	-	Chủng không đặc hiệu

6 Ðọc kết quả
Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu.

Xem chi tiết

Giáo trình vệ sinh và an toàn thực phẩm

Giáo trình vệ sinh và an toàn thực phẩm - Trường Đại học kỹ thuật TP HCM

Giáo trình vệ sinh và an toàn thực phẩm được bien soạn nhằm cung cấp các kiến thức về vệ sinh thực phẩm cho sinh viên ngành công nghệ thực phẩm. Đồng thời sách cũng là tài liệu tham khảo cho sinh viên, kỹ sư và cán bộ khoa học có liên quan đến ngành công nghệ thực phẩm.

LỜI NÓI ĐẦU
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 2: NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI SINH VẬT
CHƯƠNG 3: NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM THỰC PHẨM CHỨA ĐỘC TỐ
CHƯƠNG 4: NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO CÁC QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN THỰC PHẨM
CHƯƠNG 5: NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO CÁC CHẤT PHỤ GIA THỰC PHẨM
CHƯƠNG 6: NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO PHÂN HOÁ HỌC VÀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT
CHƯƠNG 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT THỰC PHẨM
CHƯƠNG 8: QUẢN LÝ CHẤT LƯỢNG VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM
TÀI LIỆU THAM KHẢO
MỤC LỤC

http://www.mediafire.com/?svi5krz0wny29bk

Xem chi tiết

Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí

1.1 Nguyên tắc

Tổng vi sinh vật hiếu được đếm bằng cách đổ và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30⁰C/72±6 giờ

1.2 Môi trường và thiết bị

- Dịch pha loãng: Saline Peptone Water (SPW)

- Môi trường nuôi cấy: Platecount agar (PCA)

- Tủ ấm: 30 ±1⁰C

1.3 Quy trình.

- Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau khi đã đồng nhất hoặt đã pha loãng ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng, mỗ nồng độ một đĩa. Trong 15 phút, đỗ vào mỗi đĩa 15-20ml môi trường nuôi cấy (PCA) đã được làm nguội đến 45⁰C . Sau đó trộn điều mẫu và môi trường nuôi cấy

- Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ trong 72±6 giờ ở 30±1⁰C

1.4 Đọc kết quả

Đọc kết quả có thẻ dùng mắt thường hoạc qua kính lúp có độ phóng đại 2,3 lần để đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩ petri (chỉ đếm đĩa petri có số khuẩn lạc 30-350 khuẩn lạc) sau đó nhân với hệ số pha loãng.

2. Coliforms

- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 44 ấn bản lần 4, 1995

2.1 Nguyên tắc

Dựa vào sự lên lên men đường lactose ở môi trường thích hợp (thạch Violet red bile)  ở 37⁰C trong 24 giờ. Sau đó được khảng định lại trong môi trường canh Brilliant Green Bile Salt. Coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37⁰C trong 24 giờ.

2.2 Môi trường và thiết bị

- Dung dịch Salin Pepton

- Thạch Violet red bile (VRBL)

- Canh Brilliant Green Bile Salt (BGBL)

- Thạch Tryptone Soya (TSA)

- Tủ ấn 37±1⁰C

2.3 Quy trình

- Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau khi đã pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng, sử dụng hai nồng độ pha loãng liên tiếp. Đổ vào môic đĩa khoản 5ml môi trường TSA ở 45⁰C. Sau đó cho môi trường đông hoàn toàn đổ thên 10-15ml môi trường thạch VRBL 45⁰C

- Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ trong 24±3 giờ ở 37±1⁰C

2.4 Đọc kết quả

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 100 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc coliforms có màu đỏ tía, đường kính 0.5mm, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ do tủa. Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng đê qui về số coliform trong một g mẫu.

2.5 Khẳng định.

Cấy riêng ít nhất 5 khuẩn lạcn nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa môi trường canh BGBL có ống Durham , ủ ở 37⁰C trong 24 giờ. Phản ứng được coi là dương tính khi có sự tạo khí dù chỉ một trong 5 ống nghiệm trên.

3. Escherichia coli

- Phương pháp: tham chiếu theo TCVN 5287, ấn bản lần 2, 1994

3.1 Nguyên tắc

Cấy một lượng dịch mẫu vào môi trường tăng sinh (canh Brilliant green bile lactose), lựa các khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc (EMB) để các phép thử sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC)

3.2 Môi trường và thiết bị

- Dung dịch Saline (SPW).

- Canh Brilliant green bile lactose BGBL.

- Thạch Eosin Methylene Blue Lactose (EMB)

- Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP)

- Canh Tryptone (hoặc peptone)

- Thạch Simmons Citrat

- Thuốc thử Methyl red 0,2%, α-naphtol 5%, kovac’s.

- Dung dịch KOH 40%

- Tủ ấm 37±1⁰C, 44±1⁰C

3.3 Quy trình

- Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu nồng độ 10^-1 vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tăng sinh (BGBL), ủ 44,0±0,5⁰C 24 giờ.

- Cấy phân lập: Sau khi tăng sinh cấy dịch mẫu từ ống nghiệm có phản ứng dương tính (môi trường chuyển đục và sinh hơi) sang môi trường EMB, ủ 37±1/24 giờ. Trên môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ điều, đường kính khoảng 0,5mm

3.4 Khẳng định

- Chọn ích nhất 2 khuẩn lạc điển hìnhtreen môi trường chọn lọc sang môi trường thạch không chọn lọc (TSA) ủ ở 37±1⁰C trong 19-24 giờ.

- Kết quae thử nghiệm sinh hóa E. coli phù hợp: indol(+), methyl red(+), voges proskauer(-), khẳng sử dụng citrat(-)

3.5 Đọc kết quả & báo cao

Phát hiện hay không phát hiện

4. Salmonella
- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 71 ấn bản lần 5. Năm 1999


4.1 Nguyên tắc
- Phương pháp này chỉ dùng để định tính phát hiện hay không phát hiện
- Quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua bốn gia đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh, phân lập và khẳng định.


4.2 Môi trường và thiết bị
- Canh Peptone đệm (BPW).
- Canh Rappaport-Vasiliadis soy peptone.
- Thạnh Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)
- TSI, TSA
- Canh Lysine decarboxylase, Urea phenol red, Manitol Phenol red báe
- Bể điều nhiệt ±0.2⁰C
- Tủ ấm 37±1⁰C


1.3 Quy trình
- Lấy mẫu: Lấy mãu ở vùng bề mặt càng rộng càng tốt
- Tiền tăng sinh: trộn 25g mẫu với 225ml nước đệm peptone đệm, đônh nhất nhất băng máy dập mẫu. Ủ ở 37±0,1⁰C từ 18 đến 24 giờ
- Phân lập: tu môi trường sinh cấy chuyển khuẩn dịch lên bề mặt môi trường phân lập XLD sao cho co thể tạo được những khuẩn lạc tách rời. Lật ngược đĩa ủ ở 37±0,2⁰C trong 24±3 giờ. Trên môi trương XLD khuẩn lac Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường, phần lớn có tâm đen. Bao giờ cũng nhận thấy một vung môi trường đỏ lớn hay nhỏ.


4.4 Khẳng định
Những khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra khảng định bằng thử nghiệm sinh hóa: Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urease (-), Indol (-), Mannitol (+), VP (-), LDC (+), ODC (+) và amygdaline (-)


4.5 Đọc kết quả & báo cáo
Phát hiện hay không phát hiện

5. Clostridium perfringens
- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 56 ấn bản lần 3. Năm 1994

5.1 Nguyên tắc
Định lượng Clostridium bằng cánh cấy một lượng mẫu đã biết vào môi trường thích hợp có chứa ion Fe³⁺ và ion (S₂O₃)^2- ủ ở 37⁰C trong 1-2 ngày

5.2 Môi trường và thiết bị
- Thạch iron sulphite
- Dung dich muối peptone pha loãng

5.3 Quy trình
- Cấy mẫu: Chuyển 1ml mẫu ở nồng độ thích hợp vào ống nghiệm. Sau đó, đổ 12ml môi trường thạch iron sulphite vào ống trộn điều mẫu trước khi môi trường đông lại. Sau khi môi trường đông đổ thêm 2-3ml môi trường thạch iron sulphite lên bề mặt ủ ở 37±1⁰C trong 28-48 giờ

5.4 Đọc kết quả
- Đếm tất cả khuẩn lạc đen, xung quanh có quầng đen nhân với nồng độ pha loãng

6. Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus
- Phương pháp: tham chiếu theo sổ tay phân tích vi sinh FDA , ấn bản lần 8, năm 1995

 6.1 Nguyên tắc
- Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. từ đây dịch khuẩn được cấy chuyền sang môi trường rắn chọn lọc. những khuẩn lạc giống Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.

6.2 Môi trường và thiết bị

- Thạch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar)

- Peptone kiềm chứa 1% Nacl (APW)

- TSA + 1,5 %Nacl

- Tủ ấm 37±1⁰C

6.3 Quy trình
Tăng sinh: Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW. Dập mẫu 2 phút, ủ ở 37±1 ⁰C trong 6 giờ và 16-24 giờ
Phân lập và đọc kết quả: từ môi trường tăng sinh cấy ria vào môi trường TCBS thạch ủ  ở 37,0 ±  1,0⁰C trong 18 - 24 giờ.
Trên môi trường TCBS thạch khuẩn lạc V. cholerae tròn, lớn có đường kính 2-3mm hơi dẹt, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh. V. parahaemolyticus  tròn, lớn có đường kính 3-4mm , màu xanh dương

6.4 Thử nghiệm sinh hóa
-Khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 1,5% NaCl. ủ ở nhiệt độ 37,0± 1,0^oC trong 18 - 24 giờ.


+ Thử nghiệm sơ bộ:

Phép thử	Phản ứng tiêu biểu của Virio parahaemolyticus	Phản ứng tiêu biểu của Virio Cholerae
TSI	K/A --	K/A --
Tinh duy động	+	+
Oxydase	+	+
KOH	+	+

+ Thử nghiệm khẳng định

Phép thử	Phản ứng tiêu biểu của Virio parahaemolyticus	Phản ứng tiêu biểu của Virio Cholerae
Tính chịu mặn 0% NaCl 3% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl	- - + + -	+ + - - -
Lên men sinh axít từ Sucrose Lactose Maninitol	- - +	+ - +
ONPG	-	+
ADH	-	-
LDC	+	+
Urease	-	+

6.5 Báo kết quả
Phát hiện hay không phát hiện

7. Staphylococci aureus Coagulase positive
- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 66 ấn bản lần 3, 1999

7.1 Nguyên tắc
Định lương St. aureus Coagulase positive được thực hiện bằng cánh cấy trang một lượng mẫu đã biết lên môi trường thạnh Bard Parker, vi khuẩn cho những khuẩn lạc đặt trưng. Và được xác định bằng phản ứng coagulase

7.2 Môi trường và thiết bị
- Dung dịch Saline Peptone
- Thạch Trypton Soya
- Thạch Bảid Parker
- Canh Brain Heart Infusion (BHI)
- Huyết thanh thỏ
- Tủ ấn 37±1⁰C


7.3 Quy trình
Cấy trang 1ml mẫu vào 3 đĩa đĩa petri . lật ngược các đĩa và ủ ở 37±1⁰C  trong 24±3 giờ và 48±4 giờ

7.4 Đọc kết quả
- Sau 24±3 giờ, trên môi trường Baird Paker khuẩn lạc Staphylococci aureus Coagulase positive có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng và lồi. Mỗi khuẩn lạc có quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình sẽ được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa.
- Sau 48 giờ Staphylococci aureus Coagulase positive 1,5-2mm có màu đen, sáng và lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là một vùng sáng trong rộng 2-4mm .
- Một vài chủng St. aureus không tạo quầng  sáng trong bao quanh, vùng đục sát khuẩn lạc cũng có thê không có (khuẩn lạc không điển hình). Cả hai loại khuẩn lạc này điều được đánh dấu mặt sau của đĩa

7.5 Khẳng định
Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và không điển hình sang môi trường TSA ủ ở 37±1⁰C trong 24 giờ. Từ môi trường TSA cấy chuyển vi khuẩn sang các ống nghiệm có chứa 0,3ml huyết tương thỏ ủ ở 37±1⁰C. kiểm tra sự hình thành khối đông sau 1,3,6 và 24 giờ. Kết quả Dương tinh có sự hình thành khối đông. Âm tính không có sự hình thành khối đông

Xem chi tiết