Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí

1.1 Nguyên tắc

Tổng vi sinh vật hiếu được đếm bằng cách đổ và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30⁰C/72±6 giờ

1.2 Môi trường và thiết bị

- Dịch pha loãng: Saline Peptone Water (SPW)

- Môi trường nuôi cấy: Platecount agar (PCA)

- Tủ ấm: 30 ±1⁰C

1.3 Quy trình.

- Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau khi đã đồng nhất hoặt đã pha loãng ở nồng độ thích hợp vào đĩa petri vô trùng, mỗ nồng độ một đĩa. Trong 15 phút, đỗ vào mỗi đĩa 15-20ml môi trường nuôi cấy (PCA) đã được làm nguội đến 45⁰C . Sau đó trộn điều mẫu và môi trường nuôi cấy

- Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ trong 72±6 giờ ở 30±1⁰C

1.4 Đọc kết quả

Đọc kết quả có thẻ dùng mắt thường hoạc qua kính lúp có độ phóng đại 2,3 lần để đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩ petri (chỉ đếm đĩa petri có số khuẩn lạc 30-350 khuẩn lạc) sau đó nhân với hệ số pha loãng.

2. Coliforms

- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 44 ấn bản lần 4, 1995

2.1 Nguyên tắc

Dựa vào sự lên lên men đường lactose ở môi trường thích hợp (thạch Violet red bile)  ở 37⁰C trong 24 giờ. Sau đó được khảng định lại trong môi trường canh Brilliant Green Bile Salt. Coliforms sẽ sinh khí trong môi trường này ở 37⁰C trong 24 giờ.

2.2 Môi trường và thiết bị

- Dung dịch Salin Pepton

- Thạch Violet red bile (VRBL)

- Canh Brilliant Green Bile Salt (BGBL)

- Thạch Tryptone Soya (TSA)

- Tủ ấn 37±1⁰C

2.3 Quy trình

- Đỗ đĩa: chuyển 1ml dung dịch dung dịch mẫu sau khi đã pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng, sử dụng hai nồng độ pha loãng liên tiếp. Đổ vào môic đĩa khoản 5ml môi trường TSA ở 45⁰C. Sau đó cho môi trường đông hoàn toàn đổ thên 10-15ml môi trường thạch VRBL 45⁰C

- Nuôi ủ: Các đĩa được lật ngược và ủ trong 24±3 giờ ở 37±1⁰C

2.4 Đọc kết quả

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới 100 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc coliforms có màu đỏ tía, đường kính 0.5mm, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ do tủa. Tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng đê qui về số coliform trong một g mẫu.

2.5 Khẳng định.

Cấy riêng ít nhất 5 khuẩn lạcn nghi ngờ của mỗi loại vào các ống nghiệm chứa môi trường canh BGBL có ống Durham , ủ ở 37⁰C trong 24 giờ. Phản ứng được coi là dương tính khi có sự tạo khí dù chỉ một trong 5 ống nghiệm trên.

3. Escherichia coli

- Phương pháp: tham chiếu theo TCVN 5287, ấn bản lần 2, 1994

3.1 Nguyên tắc

Cấy một lượng dịch mẫu vào môi trường tăng sinh (canh Brilliant green bile lactose), lựa các khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc (EMB) để các phép thử sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC)

3.2 Môi trường và thiết bị

- Dung dịch Saline (SPW).

- Canh Brilliant green bile lactose BGBL.

- Thạch Eosin Methylene Blue Lactose (EMB)

- Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP)

- Canh Tryptone (hoặc peptone)

- Thạch Simmons Citrat

- Thuốc thử Methyl red 0,2%, α-naphtol 5%, kovac’s.

- Dung dịch KOH 40%

- Tủ ấm 37±1⁰C, 44±1⁰C

3.3 Quy trình

- Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu nồng độ 10^-1 vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tăng sinh (BGBL), ủ 44,0±0,5⁰C 24 giờ.

- Cấy phân lập: Sau khi tăng sinh cấy dịch mẫu từ ống nghiệm có phản ứng dương tính (môi trường chuyển đục và sinh hơi) sang môi trường EMB, ủ 37±1/24 giờ. Trên môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ điều, đường kính khoảng 0,5mm

3.4 Khẳng định

- Chọn ích nhất 2 khuẩn lạc điển hìnhtreen môi trường chọn lọc sang môi trường thạch không chọn lọc (TSA) ủ ở 37±1⁰C trong 19-24 giờ.

- Kết quae thử nghiệm sinh hóa E. coli phù hợp: indol(+), methyl red(+), voges proskauer(-), khẳng sử dụng citrat(-)

3.5 Đọc kết quả & báo cao

Phát hiện hay không phát hiện

4. Salmonella
- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 71 ấn bản lần 5. Năm 1999


4.1 Nguyên tắc
- Phương pháp này chỉ dùng để định tính phát hiện hay không phát hiện
- Quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua bốn gia đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh, phân lập và khẳng định.


4.2 Môi trường và thiết bị
- Canh Peptone đệm (BPW).
- Canh Rappaport-Vasiliadis soy peptone.
- Thạnh Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)
- TSI, TSA
- Canh Lysine decarboxylase, Urea phenol red, Manitol Phenol red báe
- Bể điều nhiệt ±0.2⁰C
- Tủ ấm 37±1⁰C


1.3 Quy trình
- Lấy mẫu: Lấy mãu ở vùng bề mặt càng rộng càng tốt
- Tiền tăng sinh: trộn 25g mẫu với 225ml nước đệm peptone đệm, đônh nhất nhất băng máy dập mẫu. Ủ ở 37±0,1⁰C từ 18 đến 24 giờ
- Phân lập: tu môi trường sinh cấy chuyển khuẩn dịch lên bề mặt môi trường phân lập XLD sao cho co thể tạo được những khuẩn lạc tách rời. Lật ngược đĩa ủ ở 37±0,2⁰C trong 24±3 giờ. Trên môi trương XLD khuẩn lac Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường, phần lớn có tâm đen. Bao giờ cũng nhận thấy một vung môi trường đỏ lớn hay nhỏ.


4.4 Khẳng định
Những khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra khảng định bằng thử nghiệm sinh hóa: Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urease (-), Indol (-), Mannitol (+), VP (-), LDC (+), ODC (+) và amygdaline (-)


4.5 Đọc kết quả & báo cáo
Phát hiện hay không phát hiện

5. Clostridium perfringens
- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 56 ấn bản lần 3. Năm 1994

5.1 Nguyên tắc
Định lượng Clostridium bằng cánh cấy một lượng mẫu đã biết vào môi trường thích hợp có chứa ion Fe³⁺ và ion (S₂O₃)^2- ủ ở 37⁰C trong 1-2 ngày

5.2 Môi trường và thiết bị
- Thạch iron sulphite
- Dung dich muối peptone pha loãng

5.3 Quy trình
- Cấy mẫu: Chuyển 1ml mẫu ở nồng độ thích hợp vào ống nghiệm. Sau đó, đổ 12ml môi trường thạch iron sulphite vào ống trộn điều mẫu trước khi môi trường đông lại. Sau khi môi trường đông đổ thêm 2-3ml môi trường thạch iron sulphite lên bề mặt ủ ở 37±1⁰C trong 28-48 giờ

5.4 Đọc kết quả
- Đếm tất cả khuẩn lạc đen, xung quanh có quầng đen nhân với nồng độ pha loãng

6. Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus
- Phương pháp: tham chiếu theo sổ tay phân tích vi sinh FDA , ấn bản lần 8, năm 1995

 6.1 Nguyên tắc
- Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. từ đây dịch khuẩn được cấy chuyền sang môi trường rắn chọn lọc. những khuẩn lạc giống Virio Cholerae và Virio parahaemolyticus được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.

6.2 Môi trường và thiết bị

- Thạch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar)

- Peptone kiềm chứa 1% Nacl (APW)

- TSA + 1,5 %Nacl

- Tủ ấm 37±1⁰C

6.3 Quy trình
Tăng sinh: Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW. Dập mẫu 2 phút, ủ ở 37±1 ⁰C trong 6 giờ và 16-24 giờ
Phân lập và đọc kết quả: từ môi trường tăng sinh cấy ria vào môi trường TCBS thạch ủ  ở 37,0 ±  1,0⁰C trong 18 - 24 giờ.
Trên môi trường TCBS thạch khuẩn lạc V. cholerae tròn, lớn có đường kính 2-3mm hơi dẹt, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh. V. parahaemolyticus  tròn, lớn có đường kính 3-4mm , màu xanh dương

6.4 Thử nghiệm sinh hóa
-Khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 1,5% NaCl. ủ ở nhiệt độ 37,0± 1,0^oC trong 18 - 24 giờ.


+ Thử nghiệm sơ bộ:

Phép thử	Phản ứng tiêu biểu của Virio parahaemolyticus	Phản ứng tiêu biểu của Virio Cholerae
TSI	K/A --	K/A --
Tinh duy động	+	+
Oxydase	+	+
KOH	+	+

+ Thử nghiệm khẳng định

Phép thử	Phản ứng tiêu biểu của Virio parahaemolyticus	Phản ứng tiêu biểu của Virio Cholerae
Tính chịu mặn 0% NaCl 3% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl	- - + + -	+ + - - -
Lên men sinh axít từ Sucrose Lactose Maninitol	- - +	+ - +
ONPG	-	+
ADH	-	-
LDC	+	+
Urease	-	+

6.5 Báo kết quả
Phát hiện hay không phát hiện

7. Staphylococci aureus Coagulase positive
- Phương pháp: tham chiếu theo phương pháp NMKL 66 ấn bản lần 3, 1999

7.1 Nguyên tắc
Định lương St. aureus Coagulase positive được thực hiện bằng cánh cấy trang một lượng mẫu đã biết lên môi trường thạnh Bard Parker, vi khuẩn cho những khuẩn lạc đặt trưng. Và được xác định bằng phản ứng coagulase

7.2 Môi trường và thiết bị
- Dung dịch Saline Peptone
- Thạch Trypton Soya
- Thạch Bảid Parker
- Canh Brain Heart Infusion (BHI)
- Huyết thanh thỏ
- Tủ ấn 37±1⁰C


7.3 Quy trình
Cấy trang 1ml mẫu vào 3 đĩa đĩa petri . lật ngược các đĩa và ủ ở 37±1⁰C  trong 24±3 giờ và 48±4 giờ

7.4 Đọc kết quả
- Sau 24±3 giờ, trên môi trường Baird Paker khuẩn lạc Staphylococci aureus Coagulase positive có đường kính 1-1,5mm, màu đen sáng và lồi. Mỗi khuẩn lạc có quầng sáng rộng 1-2mm bao quanh. Những khuẩn lạc điển hình sẽ được đánh dấu trên mặt sau của đĩa và tiếp tục ủ thêm 24 giờ nữa.
- Sau 48 giờ Staphylococci aureus Coagulase positive 1,5-2mm có màu đen, sáng và lồi, quanh khuẩn lạc có một vùng đục mờ hẹp, tiếp đó là một vùng sáng trong rộng 2-4mm .
- Một vài chủng St. aureus không tạo quầng  sáng trong bao quanh, vùng đục sát khuẩn lạc cũng có thê không có (khuẩn lạc không điển hình). Cả hai loại khuẩn lạc này điều được đánh dấu mặt sau của đĩa

7.5 Khẳng định
Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và không điển hình sang môi trường TSA ủ ở 37±1⁰C trong 24 giờ. Từ môi trường TSA cấy chuyển vi khuẩn sang các ống nghiệm có chứa 0,3ml huyết tương thỏ ủ ở 37±1⁰C. kiểm tra sự hình thành khối đông sau 1,3,6 và 24 giờ. Kết quả Dương tinh có sự hình thành khối đông. Âm tính không có sự hình thành khối đông