28 TCN198 : 2004: Histamin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Histamin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Histamin in fishery products - Method for quantitative analysis by High Performance Liquid Chromatography

1 Ðối tượng và phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng histamin trong sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5 mg/kg.
2 Phương pháp tham chiếu
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo Tiêu chuẩn NMKL số 99 - 1981(Nordic committee on food analysis No 99 -1981).
3 Nguyên tắc
Histamin có trong mẫu thủy sản được tách chiết bằng metanol. Dịch chiết được làm sạch trên cột trao đổi anion; sau đó, được tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-Phthal alđehyt (OPT). Hàm lượng dẫn xuất histamin được định lượng trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.

4 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất, dung dịch chuẩn và dung dịch thử

 4.1 Thiết bị, dụng cụ

 4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.

 4.1.2 Cột sắc ký lỏng C18, kích thước cột L x ID: 50 x 4,6 mm, kích thước hạt: 5 mm.

 4.1.3 Máy nghiền đồng thể tốc độ 6 000 - 30 000 vòng/phút (HEIDOLPH DIAX 900).

 4.1.4 Bể điều nhiệt hoạt động ở nhiệt độ 20 -100^oC (GRANT Y14).

 4.1.5 Máy lắc tốc độ 50 - 500 vòng/phút (IKA ề KS 260 basic).

 4.1.6 Máy đo pH, dải pH từ 2 đến 12 (Knick 766).

 4.1.7 Cân phân tích, độ chính xác 0,0001 g.

 4.1.8 Cột thủy tinh (khóa teflon, kích thước: 300 x 10,5 mm ID x 13 mm OD). 4.1.9 Bình tam giác, bình định mức và pipet thủy tinh các loại.

4.1.10 Giấy lọc 0.45 mm (Whatman No.1).

4.2 Hoá chất Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm:

4.2.1 Nước cất dùng cho HPLC.

 4.2.2 Metanol dùng cho HPLC.

 4.2.3 Axetonitril dùng cho HPLC.

 4.2.4 Axit clohyđric (HCl) đậm đặc 37 %.

 4.2.5 Natri hyđroxit (NaOH) rắn.

 4.2.6 Kali đihyđro phosphat (KH₂PO₄) rắn.

 4.2.7 o-Phthal alđehyt (OPT) 99%, được bảo quản lạnh.

 4.2.8 Trietylamin (TEA).

 4.2.9 Histamin đihyđroclorua (C₅H₁₁Cl₂N₃), M = 184,07 g/mol.

 4.2.10 Axit phosphoric (H₃PO₄) đậm đặc 85 %.

     4.2.11 Nhựa trao đổi anion, Dowex loại 1 x 8, kích thước hạt 50 -100 mesh.

     4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

4.3.1 Các dung dịch chuẩn histamin

  4.3.1.1 Dung dịch chuẩn histamin gốc 1000 mg/l: hoà tan 0,1656 g histamin đihyđroclorua (4.2.9) trong axit HCl 0,1 M rồi định mức đến 100 ml. Dung dịch này bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh.

 4.3.1.2 Dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l: pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn gốc histamin 1000 mg/ l (4.3.1.1) với dung dịch axít HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi định mức đến 100 ml. Dung dịch này bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh.

 4.3.1.3 Các dung dịch chuẩn histamin làm việc: pha loãng lần lượt 1; 2 và 3 ml dung dịch chuẩn histamin 10 mg/l (4.3.1.2) trong dung dịch axit HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi định mức đến 100 ml để được các dung dịch chuẩn 0,1; 0,2 và 0,3 mg/l. Chuẩn bị mới các dung dịch chuẩn mỗi khi phân tích.

 4.3.2 Các dung dịch thử

4.3.2.1 Dung dịch axit HCl 2,5 M: pha loãng 125 ml axit HCl (4.2.4) trong nước cất (4.2.1) để có 500 ml.

4.3.2.2 Dung dịch axit HCl 1 M: pha loãng 40 ml dung dịch axit HCl 2,5 M (4.3.2.1) trong nước cất để có 100 ml.

4.3.2.3 Dung dịch axit HCl 0,1 M: pha loãng 10 ml dung dịch axit HCl 1 M (4.3.2.2) trong nước cất để có 100 ml

4.3.2.4 Dung dịch NaOH 1 M: hòa tan 40 g NaOH (4.2.5) trong 1000 ml nước cất.

4.3.2.5 Dung dịch OPT: hòa tan 0,100 mg OPT (4.2.7) trong 100 ml metanol (4.2.2). Dung dịch bền trong 1 tuần lễ nếu được bảo quản lạnh trong chai sẫm màu.

4.3.2.6 Dung dịch H₃PO₄ 1,19 M: pha loãng 121,8 ml H₃PO₄ đậm đặc 85% (4.2.10) với nước cất (4.2.1) để có 1000 ml.

4.3.3 Chuẩn bị nhựa trao đổi anion: nhựa trao đổi anion được đổ vào trong dung dịch NaOH 1 M (4.3.2.4) với tỉ lệ tương ứng 15 ml NaOH/1 g nhựa. Tiến hành khuấy đều dung dịch, để yên ít nhất trong 30 phút rồi gạn bỏ phần dung dịch. Lặp lại thao tác trên. Cuối cùng rửa nhựa với nước cất. Sau đó, đổ nhựa lên giấy lọc rồi rửa nhiều lần với nước cất (4.2.1) cho đến khi hết NaOH. Nhựa bảo quản được 1 tuần trong nước cất.

4.3.4 Chuẩn bị pha động: hòa tan 1.089 g KH₂PO₄ (4.2.6) trong gần 600 ml nước ((4.2.1). Thêm 100 ml axetonitril (4.2.3) và 0,10 ml TEA (4.2.8), chỉnh pH đến 7,30 + 0,05 trên máy đo pH (4.1.6). Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 1000 ml (4.1.9) rồi định mức tới vạch bằng nước cất (4.2.1). Chú thích: trong quá trình chuẩn bị pha động, dung dịch phải được lọc qua giấy lọc 0,45mm (4.1.10) và đuổi khí bằng bể siêu âm trước khi sử dụng.

 5 Phương pháp tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền đồng thể (4.1.3). Cân chính xác 10 g mẫu đã được nghiền đồng thể (kí hiệu W) cho vào bình tam giác 150 ml (4.1.9).

5.1.2 Thêm 50 ml metanol (4.2.2), lắc đều trong 2 phút. Ðặt bình chứa dung dịch mẫu trên bể điều nhiệt (4.1.4) ở nhiệt độ 60^oC trong 15 phút . Sau đó, chuyển toàn bộ sang bình định mức 100 ml; tráng bình tam giác bằng metanol (4.2.2).

 5.1.3 Ðể nguội dung dịch tới nhiệt độ trong phòng rồi định mức đến vạch bằng metanol (4.2.2) để có 100 ml (kí hiệu V₁). Lắc đều dung dịch rồi lọc qua giấy lọc (4.1.10). Dịch chiết này bền được vài tuần lễ nếu được bảo quản lạnh.

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu thuỷ sản đã được xác định không chứa histamin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định t aị Ðiều 5.1.
5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ppm
Thêm chính xác 1 ml dung dịch chuẩn histamin 1000 mg/l (4.3.1.1) vào 10 g mẫu trắng đã được nghiền đồng thể. Tiến hành chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định t aị Ðiều 5.1.

5.4 Làm sạch mẫu

5.4.1 Chuẩn bị cột làm sạch Nhồi nhựa trao đổi anion đã được chuẩn bị (4.3.3) vào cột thủy tinh (4.1.8) đến chiều cao khoảng 8 cm và giữ không để khô cột. Trước khi sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml nước cất (4.2.1).

 5.4.2 Làm sạch mẫu Lần lượt cho 1 ml dịch chiết thu được tại các Ðiều 5.1, 5.2 và 5.3 (kí hiệu V₂) qua cột, rồi rửa cột bằng 4 - 5 ml nước cất (4.2.1). Thu dịch chảy ra vào bình 50 ml đã chứa 5 ml dung dịch axit HCl 1 M (4.3.2.2). Khi lớp dung dịch cách mặt trên lớp nhựa khoảng 2 mm phải cho tiếp nước cất (4.2.1) vào cột cho đến khi thu được khoảng 35 ml dịch giải hấp. Khóa cột rồi định mức phần dịch giải hấp thu được bằng nước cất (4.2.1) để có 50 ml (kí hiệu V₃).

5.5 Tạo dẫn xuất huỳnh quang

 5.5.1 Dung dịch xác định đường chuẩn

Hút chính xác 5 ml các dung dịch chuẩn histamin làm việc (4.3.1.3) vào các bình định mức 50 ml, thêm 3 ml dung dịch NaOH 1 M (4.3.2.4) vào mỗi bình rồi lắc đều. Sau khoảng 5 phút, thêm 1 ml dung dịch OPT (4.3.2.5) vào mỗi bình. Sau đúng 4 phút, tiếp tục thêm 3 ml dung dịch H₃PO₄1,19 M (4.3.2.6) vào mỗi bình, định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M (4.3.2.3) rồi lắc đều các bình.
Chú thích: phải lắc đều dung dịch sau mỗi lần thêm hóa chất ít nhất 1 lần trong quá trình tạo phản ứng với dung dịch OPT (4.3.2.5).

5.5.2 Mẫu trắng

Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu trắng đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1.

5.5.3 Mẫu xác định độ thu hồi

Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1.

5.5.4 Mẫu thử

Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu thử đã được làm sạch (5.4.2) vào bình tam giác 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo qui định tại Ðiều 5.5.1.

5.6 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.6.1 Ðiều kiện phân tích:

a. Cột sắc ký : cột Licrocart C18, kích thước 50 x 4,6 mm, 5 mm (4.1.2).
b. Nhiệt độ cột : 40^oC.
c. Pha động : hỗn hợp gồm: KH₂PO₄ , axetonitril và TEA (4.3.4).
d. Tốc độ dòng : 1 ml/phút.
đ. Bước sóng kích thích : l = 350 nm.
e. Bước sóng phát xạ : l = 444 nm.
g. Thể tích tiêm : 20 ml.

5.6.2 ổn định cột sắc ký trong 30 phút tại chế độ làm việc.

5.6.3 Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5.1). Dựng mối quan hệ tuyến tính của diện tích píc sắc ký theo nồng độ.

 5.6.4 Tiêm dịch chiết mẫu trắng (5.5.2); dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi (5.5.3) và dịch chiết mẫu thử (5.5.4) đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang vào hệ thống HPLC. Mỗi dịch thực hiện 2 lần. Tính diện tích trung bình và xác định nồng độ histamin trong dịch chiết từ đường chuẩn. Tính hàm lượng histamin trong mẫu theo Ðiều 6. 5.7 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

5.7.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CV_S) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%.
5.7.2 Ðộ thu hồi (R)
Ðộ thu hồi của mẫu được xác định theo mỗi lần phân tích mẫu. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 90 đến 110%.

5.7.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R²) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.

6 Tính kết quả Hàm lượng histamin có trong mẫu thử được tính theo công thức sau:

C x V1 x V3 M (mg/kg) = -----------------             W x V2

Trong đó:
- M là hàm lượng histamin có trong mẫu, tính theo mg/kg.
- C là nồng độ histamin có trong dịch chiết mẫu (5.6.4), tính theo mg/ml.
- V₁ là thể tích dịch mẫu thử (100 ml) đã được định mức (5.1).
- V₂ là thể tích dịch chiết (1 ml) chuẩn bị được làm sạch (5.4.2).
- V₃ là thể tích dịch đã được làm sạch (5.4.2) chứa trong bình định mức (50 ml).
- W là khối lượng (10 g) của mẫu thử đã được nghiền đồng thể (5.1).
Chú thích: Nếu kết quả tính trên mẫu lớn hơn 15 mg/100 g thủy sản thì phải pha loãng dịch
chiết mẫu và thực hiện lại qui trình từ Ðiều 5.4.